【vol.33】Wang 樹脂(Wang Resin)のアミノ酸をロードした時の定量方法について

October 27, 2017
Elizabeth Denton

Wang樹脂は標準的なアミノ酸をあらかじめロードされた状態で購入できますが、最初のアミノ酸を手作業でWang樹脂にカップリングが必要な場合もあります。私が合成したい配列は、C末端に非天然アミノ酸が必要だったため、市販されているものがありませんでした。

このカップリング反応にはそれなりの課題があり、そのため多くのペプチド合成に携わる人はプレロードされた樹脂の大規模なバッチ調製を行います。しかし、これについては後述します。今回の記事では、別のことを取り上げたいと思います。樹脂にロードされたアミノ酸はどのように定量するのでしょうか？

確かに、最初のアミノ酸を樹脂へカップリングして、そのまま次のアミノ酸のカップリング操作へペプチド合成に移行するグループに出会ったことがあります。この方法で進めることができます。非天然アミノ酸、時には非常に高価なアミノ酸の使用が増える中、試薬の無駄や合成コストを削減するためには、樹脂への正確なアミノ酸ローディングを知ることが重要になります。

樹脂のローディングを正確に決定するには、高度な測定精度が要求されます。この方法の説明は難しくありませんが、正確な定量を得るためには、確かな分析技術が必要です。通常、アミノ酸のローディング反応が終了し、樹脂にキャップをした後に実施しますが、反応の進行状況を把握するためにも利用できます。
Fmoc基とピペリジン付加物が紫外線照射により約300 nmで強く吸収されることを利用して、そのFmoc除去量をBeerの法則、分光測定にて定量します（式１）。

式1：UV吸収量と溶液濃度の相関を示すBeer-Lambertの法則になります。A =ある波長（x）におけるUV吸光度、ε = ある波長（x）におけるモル分光係数、l = サンプルを通る経路長（UVセルの幅）、c = サンプル濃度、単位はmol/Lになります。

Wangリンカーにうまく結合したアミノ酸の量を決定するために、以下の一般的なステップを実行する必要があります。各ステップで強調されている内容には特に注意してください。これらの詳細は、定量の成功に大きく貢献します。

これらの文献などで紹介されているアミノ酸ローディングプロトコルを実行します。
反応容器から少量の樹脂を、あらかじめ用意したバイアルに取り出します。
取り出した樹脂を十分に洗浄します。ここでの目的は、樹脂マトリックスに捕捉された可能性のある残留DMFを除去することです。DMFを完全に除去するために、しばしば異なる溶媒を用いた洗浄サイクルを行います（例えば、PEG系樹脂を使用する場合は、DCMとジエチルエーテルを交互に使用することもあります）。
樹脂を完全に乾燥させます（通常は真空引きで）。正確な定量を行うためには、樹脂は非常に乾燥していなければなりません。残留溶媒の重量が定量に影響してはいけません!
乾燥した樹脂を秤量します。
樹脂は、20%ピペリジンDMF溶液（既知量）に懸濁させます。Fmoc脱保護溶液を正確に供給することは、レジン負荷の正確な定量に不可欠です。
標準的な方法でFmoc脱保護プロトコルを実行します。
Fmoc脱保護溶液を全量回収します。ステップ6で送液量の正確さが重要だったように、ここでも回収量の正確さが同様に重要です。
調整した20%ピペリジンDMF溶液でUVスペクトルをゼロにします。これらの測定には、吸光度ピークとそれに対応する最大吸収波長を完全に可視化するために、波長スキャン機能を使用することを推奨いたします。あるいは、301 nmの吸光度値を直接測定することもできます。
回収した脱保護溶液は、20%ピペリジンDMF溶液で希釈します。希釈量は、今回の分析に用いた樹脂の量や、Fmoc 脱保護に用いた脱保護溶液量に依存します。Beerの法則は、吸光度が約0.1～1AUの範囲でのみ線形であることを忘れないでください。
希釈した脱保護液の波長（～301 nm）の吸光度を測定します。
脱保護反応中に放出される Fmoc のモル数を Beer の法則を用いて計算します。この希釈法で Fmoc基とピペリジン負荷物のモル吸光係数は 6000 M^-1·cm^-1 と報告されています。この計算では、希釈倍率を補正することを忘れないでください。希釈した濃度ではなく、実際の溶液の濃度が必要です。