【vol.41】フラッシュクロマトグラフィーシステムにELSDを追加すべき理由

Bob Bickler

ELSD（蒸発光散乱検出器）は、多くの市販のフラッシュクロマトグラフィーシステムで使用できるアクセサリです。主に糖類のような紫外線（UV）での検出が困難な化合物を検出するために使用され、熱、窒素、およびLEDまたはレーザー光源を用いて蒸発した化合物粒子を検出しますその実用性はUV吸収を持たない化合物の検出にとどまらず、フラッシュシステムにELSDを追加することを検討すべき理由となっています。

ELSDは他にどのような用途に対応できるのでしょうか? 精製で使用される溶媒によってUV吸収が妨げられる分子を効果的に検出できます。多くの有機化合物と同じ波長範囲でUVを吸収する溶媒がいくつかあり、これはクロマトグラフィーにおいて一般的な課題となっています。

最も一般的なフラッシュクロマトグラフィーの溶媒の1つは酢酸エチル（EtOAc）で、通常ヘキサンまたはヘプタンと共に使用されます。飽和炭化水素溶媒とは異なり、酢酸エチルはUVを透過しません。 198～252nmの範囲でUVを吸収し、最大吸収は220 nm付近にあります（図1参照）。

図1. EtOAcのUVスペクトル

多くの合成化合物は254 nm以下の波長で最も強くUVを吸収するため、酢酸エチル（EtOAc）をクロマトグラフィー溶媒として使用すると検出が難しくなることがあります。

例えば、2段階のイミド合成を考えてみましょう。最初の合成では、マレイン酸無水物と1,3-シクロヘキサジエンによる古典的なDiels-Alder反応を行い、ビシクロ[2.2.2]オクタ-5-エン-2,3-ジカルボン酸無水物を生成しました（図2参照）。

図2. Diels-Alder反応。

化合物の分離は、カラムメディア上での化合物の滞留時間と移動相におけるその化合物の溶解性のバランスであることを忘れないでください。グラジエントを短くすると、グラジエントの傾きを一定に保った場合でも分離が低下することがあります。

この合成はアセトニトリルを反応溶媒として行われ、反応混合物は水/メタノールのグラジエントを用いた逆相フラッシュクロマトグラフィーで精製されました。反応物と生成物には少なくとも1つの二重結合が含まれており、また移動相の溶媒はUV吸収をほとんど示さないため、UV検出器で化合物を検出できる可能性があります（図3参照）。

図3.Diels-Alder後の分取精製クロマトグラム。シクロヘキサジエンを除きUV吸収ピークは低い。

図3. UV検出によるDiels-Alder精製。

しかし実際には、生成物のピークはモル吸光係数が比較的低く、合成収率が低いことを示していました。生成物は乾燥させても揮発せず固体となるため、反応混合物はELSDによる精製に適したサンプルでした。

ELSDを用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製を行うと、UV検出器よりもはるかに強い応答が得られ、より多くの生成物を回収することが可能になりました（図4参照）。

図4.ELSDとUV検出器を組み合わせたDiels-Alder後の分取精製クロマトグラム。ELSDでは目的の生成物が他と比べて一番高いピークを示した。

図4. ELSDとUV検出によるDiels-Alder精製。

ELSDで検出された生成物画分を乾燥させた後、ジクロロメタン/アセトニトリル混合溶媒に溶解し、シクロヘキシルアミンと反応させ、2-シクロヘキシル-3a,4,7,7a-テトラヒドロ-1H-4,7-エタノイソインドール-1,3(2H)-ジオン（図5）を生成しました。

図5. Imide reaction.

この反応により黄色がかったスラリーが生成され、メタノールに可溶であることが確認されました。逆相フラッシュクロマトグラフィーでは適切な精製ができなかったので、ヘプタン／酢酸エチルのグラジエントを用いた順相クロマトグラフィーを行いました。前述したように、酢酸エチル（EtOAc）は252 nm以下の波長でUVを吸収するため、生成物が1つの二重結合を含む場合、この移動相ではUV検出だけでは生成物を適切に検出するのは難しい可能性があります。そのため、ELSDを用いて溶出化合物を検出する必要がありました（図6参照）。