【vol.19】逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーを使用したイオン化化合物の精製

October 16, 2020
Bob Bickler

ほとんどのクロマトグラフィー精製では、たった 2つの溶媒で化合物同士を十分に分離することができます。しかし残念ながら、イオン性分子や極性の高い有機分子を含むようなものは、「通常の」溶出条件では分離が不十分であったり、達成できなかったりする場合があります。

この投稿では、この問題に対するいくつかの解決策を提供します。

イオン化可能な化合物は通常、水混和性であり、逆相法 を使用して分離/精製するのが最適です。これらの水溶性化合物の課題は、疎水性（C18）メディアに保持させることと、タイトなバンドで溶出することです。これは、化合物を精製する場合の目標です。これらの両方の目標を確実に達成するには、一般的には pH調整剤または緩衝液（バッファー）が必要です。

なぜか？イオン性およびイオン化可能な化合物は、溶液中で平衡を達成しようと努めているためです（大学時代の pKa、pKb などを覚えていますか？）。これらの化合物は、対イオンが親化合物から部分的に「くっつき」、部分的に「解離」した状態になっています。これらの分子は異なる平衡状態で存在するため、クロマトグラフィーは困難なものになります。イオン化したものはより極性が高く、早期に溶出する傾向があり、イオン化していないものは保持されます。これにより、テーリングやフロンティングピークが生じます（図1）。

図 1. 水/メタノール勾配を使用したイオン性有機化合物（タートラジン、アルラレッド、ブリリアントブルーFCF、およびエリスロシン（すべての食品着色料））のクロマトグラム。これらの化合物はイオン性が高く解離しやすいため、極性が高く C18 との分配能力を最小にしています。

この問題を解決するには、pHを調整して平衡状態を強制的にどちらかの状態にするか、バッファーを添加してカウンターイオン（対イオン）の会合を強制的に行う必要があります。

酸性および塩基性化合物については、可能であれば 2 pHルールに従うのが好きです。2 pHルールとは、酸をプロトン化するためには、移動相のpHを化合物のpKaより2 pH低くしなければならない、というものです。同様に、有機アミンを強制的に遊離塩基型にするためには、移動相のpHは化合物のpKaより2 pH高くなければならない。どちらの場合も、化合物が疎水化されることで逆相カラムでの保持力が高まり、通常、ローディング容量とピーク形状の改善（フラクション濃度の増加）により、より良い分離が得られるという利点がある。両方の状況の例を次に示します。

A. 酸性化合物は、移動相が酸性のときに最もよく保持・分離されます。私は、弱溶出溶媒、強溶出溶媒ともに0.1%レベルの揮発性酸を使用しています。なぜ揮発性酸なのか？回収容器から化合物を回収する際に、揮発性の酸の方が蒸発させやすいからです。

おすすめの酸は…

i. ギ酸

ii. 酢酸

iii. トリフルオロ酢酸（TFA）

図2は、有機酸（TFA）を添加した逆相クロマトグラフィーにより、3-ニトロ安息香酸（pKa 3.47）、ニコチン酸（pKa 4.85）、ホモバニリン酸（pKa 3.74）という3つの小さな有機酸を保持・分離する方法を示しています。このような低pHの移動相では、これらの酸がプロトン化されて疎水性が高くなり、保持力が高まって分離が向上し、フラッシュ精製を成功させます。

図 2. アセトニトリル/水/TFA（60：40：0.05）の移動相を使用した逆相による有機酸の精製。ピーク1は3-ニトロ安息香酸、ピーク2はニコチン酸、ピーク3はホモバニリン酸です。

B. 同様に、塩基性化合物は、移動相のpHがアルカリ性のときに、最も良好に保持・分離されます。私は弱溶媒と強溶媒の両方で0.1％レベルの揮発性塩基を使用するのが好きです。例えば…

i. 水酸化アンモニウム

ii. ジエチルアミン（DEA）

iii. トリエチルアミン（TEA）

図3に、TEAを塩基として組み込んだグラジエントを使用して、3つの有機アミンである4-ジメチルアミノアンチピリン（pKa 9.6）、N-フェニルベンジルアミン（pKa 3.5）、およびアミトリプチリン（pKa 9.4）を分離した例を示します。上記の有機酸の例と同様に、移動相のpHを化合物のpKaより2単位高い約pH 11に調整すると、疎水性と保持が向上します。これにより、分離が向上し、フラクションの回収が簡単になります（分取したフラクションに含まれる水が少なくなり、有機溶媒が多くなります）。

図 3. 逆相グラジエントフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製された有機アミン。使用した溶媒は、アセトニトリル、水、0.1％TEA でした。ピーク 1 はジメチルアミノアンチピレン、ピーク 2 は N-フェニルベンジルアミン、ピーク 3はアミトリプチリンです。

荷電性化合物や有機塩の場合は、上記の方法を用いることができますが、化合物が強酸、強塩基、双性イオン である場合（図1の食品着色料の例のように）、揮発性緩衝液（揮発性バッファー）を添加すると分離に驚異的な効果があります。このような場合、私は次の中から選択するのが好きです…

i. ギ酸アンモニウム（10 mM）

ii. 酢酸アンモニウム（10 mM）

食品着色料の例を続けると、揮発性バッファーを添加した場合のクロマトグラフィー分離の改善を図4に示します。この場合のバッファーは酢酸アンモニウム、pH 7でした。揮発性の有機バッファーを添加することで、サンプルの帯電部位はカウンターイオン（対イオン）で「中和」されます。

バッファー濃度はサンプル成分の濃度よりも高いため、サンプルの平衡はこのペアイオンの中和状態に強制され、化合物の親油性が高まり、保持力が高まります。また、イオン部位と対イオンをペアリングすることにより、化学イオン化も最小限に抑えられ、ピーク形状やバンドの広がりに影響を与えることができます（下記参照）。

図 4. 酢酸アンモニウムバッファー（pH 7）を溶媒系に加えると、イオン性化合物がより親油性になり、逆相メディアへの保持力が高まります。ピーク形状が改善され、フラクションボリュームが最小限に抑えられます。

移動相にバッファーを加えることにより、そのイオン強度を高めることもできます。イオン を加えることで、移動相の極性が増加します。これは、ウラシルとカフェインを含む DMSO 溶液の精製で見られるように、極性化合物の保持と分離を向上させるのに役立ちます（図5）。移動相のイオン強度を上げ、極性を上げると、ウラシルはC18とよりよく分配され、DMSO から少なくとも部分的に分離されます。カフェインのピーク形状もイオン強度で改善されます。